中国科学院武汉物理与数学研究所张利民研究

肠道微生物群及其代谢产物脱氧胆酸在三氯蔗糖摄入诱导的非酒精性脂肪性肝病中的作用

——中国科学院武汉物理与数学研究所张利民研究员

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近日，中国科学院武汉物理与数学研究所张利民研究院团队在国际期刊《Journal?of?Agricultural?and?Food?Chemistry》在线发表题为“GutMicrobiotaandItsMetaboliteDeoxycholicAcidContributetoSucraloseConsumption-InducedNonalcoholicFattyLiverDisease"的研究论文。ZunjiShi为一作，张利民研究员为通讯作者，中国科学院武汉物理与数学研究所为第一完成单位。

●研究背景

众所周知，日常高糖饮食会诱发肥胖和糖尿病等代谢综合征。为了减少糖的摄入，高甜度、低热量的无热量人工甜味剂(NASS)已被广泛应用于食品和饮料中。作为最常见的NASS之一，三氯蔗糖被广泛应用于当前市场上的日常食品和饮料中。以前，三氯蔗糖被普遍认为是安全的，因为它大部分直接通过胃肠道。然而，在目前的市场上，三氯蔗糖是最常见的人工甜味剂之一，被广泛用于日常食品和饮料中。以前，三氯蔗糖被普遍认为是安全的，因为它大部分直接通过胃肠道。因此，根据食品和药物管理局(FDA)的数据，目前人类三氯蔗糖的每日可接受摄入量(ADI)为5毫克/千克体重/天。然而，三氯蔗糖的安全使用相当不清楚，特别是在食品和食品加工中的使用。据报道，添加三氯蔗糖的食物加热会产生有毒的含氯化合物。最近的研究还显示，三氯蔗糖通过改变肠道微生物群落结构，显著增加了人类患糖尿病的风险。越来越多的证据还表明，三氯蔗糖通过肝脏和肠道微生物之间的相互作用，显著引发肝脏炎症，导致肝脏疾病。由此可见，三氯蔗糖对健康的影响尚不清楚，需要加以研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种由多种环境因素诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，是一种伴有脂质代谢紊乱和肝脏脂肪堆积的肝脏脂肪变性的发展状态。大量研究表明，肠道微生物代谢失调引起的全身性炎症与NAFLD的发生密切相关。摄入三氯蔗糖可改变小鼠盲肠内容物中的肠道微生物群落结构，从而导致血清脂多糖(LPS)浓度升高，最终导致全身性炎症。尤肠道微生物及其衍生的代谢产物，包括胆汁酸（BAs），吲哚代谢产物和短链脂肪酸（SCFA）在此病理过程中可能起关键作用，它们调节涉及葡萄糖，脂质和胆汁酸代谢的多个宿主代谢途径，特别是生物合成，运输，代谢和吸收的破坏。肝肠循环内正常BAs与肥胖，炎症，胆汁淤积和NAFLD等许多代谢综合征高度相关。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和NAFLD患者肝，血清和粪便中总BAs水平高。

在目前的研究中，我们假设微生物杀灭的总BAs或单个BAs有助于三氯蔗糖消耗诱导的非酒精性脂肪性肝病的发展。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(UHPLC-QQQ-MS)对长期食用三氯蔗糖后小鼠多种生物基质中的BA谱进行了靶向分析。16SrDNA的基因测序也用于评价肠道微生物群落组成的改变和筛选那些对BA代谢障碍有高度贡献的细菌。同时，进一步研究了二甲双胍或低聚果糖对三氯蔗糖诱导的非酒精性脂肪肝的缓解作用。此外，新橙皮苷二氢查尔酮(NHDC)是一种具有高甜度和抗炎活性的天然甜味剂，被欧盟(EU)列为无毒化合物。还比较评价了NHDC对小鼠BA代谢的潜在影响。

1.三氯蔗糖的消耗扰乱了苯丙氨酸的代谢，显著提高了苯丙氨酸的含量

图1用正常饮食喂养11周的小鼠的粪便、肝脏、回肠和血清中的BA成分

图2使用UHPLC-QQQ-MS对对照，NHDC-和三氯蔗糖处理的小鼠的粪便，肝脏，回肠和血清（AD）中未结合的BA进行相

图3使用UHPLC-QQQ-MS对对照组、三氯蔗糖、三氯蔗糖-/MET-和三氯蔗糖-/FOS处理的小鼠的粪便(A)、肝脏(B)、回肠(C)和血清(D)中未结合的BAs进行相对定量

BAs的靶向定量结果显示，正常饲料饲养小鼠粪便中以未结合的BAs(92.2%)为主，如DCA、CDCA、CA、LCA、UDCA、猪去氧胆酸、异LCA、ω-MCA、α-MCA和β-MCA(图1A)。相反，肝脏中的主要碱性氨基酸是结合基团，包括牛磺胆酸、牛磺酸-α-鼠李酸(T-α-MCA)、T-β-MCA、牛磺酸熊去氧胆酸、牛磺酸脱氧胆酸和牛磺酸鹅去氧胆酸(图1B)。正常饲料饲养的小鼠回肠(图1C)和血清(图1D)中结合型和非结合型BAs的分布几乎相等。长期食用三氯蔗糖后，小鼠的粪便和血清中总BA浓度显著升高(图1E，F)，而肝脏总胆固醇(T-CHO)水平显著下降(图1G)。长期食用三氯蔗糖还显著提高了小鼠肝脏Cyp7a1的mRNA水平(图1H)，Cyp7a1是编码肝细胞中胆固醇合成初级BA的关键酶。特别值得注意的是，三氯蔗糖的摄入显著上调了小鼠粪便、肝脏和血清等多种生物样本中dca的丰度(图1I?L)。相应地，摄入三氯蔗糖导致小鼠肝脏FXR及其靶向SHP基因表达显著下调(图3A，B)，而回肠FXR和肝脏Fgf15基因表达无明显变化(图3C，D)。此外，摄入三氯蔗糖还引起小鼠粪便中尿酸和β-MCA、血清中尿酸和尿酸显著升高(图2)，而结合态BAs无明显变化。趣的是，NHDC是一种天然的无毒甜味剂，对小鼠的BA代谢、肝脏T-CHO、FXR、FGF15和Cyp7a1几乎没有影响(图1，2；3A?D）

2.食用三氯蔗糖会破坏肠道微生物群，导致肠道拟杆菌和梭状芽孢杆菌显著升高

图4对照，NHDC和三氯蔗糖处理小鼠的肝Fxr，Shp，Fgf15和回肠FxrmRNA表达（A-D）。对照，三氯蔗糖，三氯蔗糖/MET和三氯蔗糖/FOS处理的小鼠的肝Fxr，Shp，Fgf15和回肠FxrmRNA表达（E-H）。

小鼠盲肠内容物中的微生物多样性显示，添加和不添加MET或FOS的对照组和三氯蔗糖组小鼠盲肠内容物的α多样性指数(观察到的OTUS)相似(P=0..16和0.08Mann?WhitneyU)(图4A)。与对照组相比，摄入三氯蔗糖(R=0.，P=0.)、三氯蔗糖/甲硫氨酸(R=0.，P=0.)和三氯蔗糖/低聚果糖(R=0.68P=0.)小鼠的细菌群落β多样性明显不同(图4B)。此外，MET(R=0.29P=0.)或FOS(R=0.，P=0.)补充组也与食用三氯蔗糖的小鼠显著分离(图4B)。具体地说，拟杆菌门、菲尔米特菌、微生物门、放线杆菌和变形杆菌是三氯蔗糖摄入量组肠道微生物群落组成的主要变化(图4C)。通常，所有初级和结合的BA都是通过bsh去结合/水解的，bsh是由肠道中的乳杆菌、类杆菌、双歧杆菌和梭状芽孢杆菌产生的。23与对照组相比，食用三氯蔗糖的小鼠的肠道类杆菌和梭状芽孢杆菌水平更高，这是通过7-α-脱羟化酶从CA转化为DCA而导致DCA积累的(图4D，E)。

3.补充MET或FOS可恢复肠道微生物区系和BA代谢

图5对照、三氯蔗糖、三氯蔗糖/MET-和三氯蔗糖/果寡糖处理小鼠盲肠内容物的微生物多样性分析

MET和FOS已被用于显著改善肥胖的人或小鼠的葡萄糖稳态和肝脏脂肪变性。33,34在本研究中，补充蛋氨酸或FOS显著恢复了长期摄入三氯蔗糖后小鼠体内总BA的破坏(图5）。具体来说，补充蛋氨酸或FOS可导致三氯蔗糖摄入小鼠粪便DCA和UDCA、肝脏DCA、血清DCA和LCA显著下调(图5A-D)。

4.细菌属与粪便BAs的关系

图6粪便胆汁酸与肠道微生物区系的Spearman等级相关分析

使用从对照、三氯蔗糖、甲基叔丁基醚或低聚果糖处理组获得的相应数据，分析了所有细菌属和粪便BAs之间的斯皮曼等级相关性(图6)。相关热图显示，UDCA和一些FXR拮抗剂(DCA、LCA和T-βMCA)的水平与梭菌属的丰度显著正相关(图6)。α-MCA、β-MCA、ω-MCA、UDCA和T-α-MCA的水平也与不同属的细菌显著正相关，包括拟杆菌属、布拉氏菌属、粪球菌属、粘螺旋菌属、嗜双胞杆菌属、克里斯滕森氏菌属和图列氏菌属(图6)。这些结果表明，肠道中的代谢物，尤其是粪便BAs，受到肠道微生物群的强烈影响。

●结论

在该研究中，肝脏中Ampk的显著上调和mTOR的显著下调表明AMPK和mTOR信号参与了硫糖铝诱导的小鼠经MET或FOS治疗后的非酒精性脂肪肝。葡萄糖耐量试验还表明，食用三氯蔗糖会导致葡萄糖耐量异常，而服用甲基苯丙胺或果糖可显著缓解这一症状。作为治疗糖尿病患者的金标准，蛋氨酸预防糖尿病的机制主要是通过调节AMPK和mTOR信号。此外，FOS是一种有效的益生元，可缓解糖尿病和非酒精性脂肪肝。先前的研究表明，多糖如蜂花粉多糖和苹果多酚提取物可通过AMPK和mTOR信号通路缓解肝脂肪变性。在此，FOS治疗可缓解由三氯蔗糖摄入引起的小鼠的葡萄糖不耐受和非酒精性脂肪肝。综上所述，补充蛋氨酸或低聚果糖可以显著减轻三氯蔗糖摄入小鼠的非酒精性脂肪性肝病，这可能是通过调节AMPK和mTOR信号通路实现的。

原文链接：

　　中国科学院武汉物理与数学研究所副研究员从事核磁共振波谱方

及其在代谢组学的应用研究

　　 　　 　　　华中师范大学优秀毕业生　

　　 　　 　　　中国科学院武汉物理与数学研究所优秀博士生

研究方向：

代谢组分析新方法以及代谢组学在毒理、纳米生物效应等的应用研究。迄今在JProteomeRes、polymer等学术刊物上发表论文十余篇。

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