部分地区禽戊型肝炎病毒分子流行病学分析

禽戊型肝炎病毒（avainhepatitisEvirus，aHEV）属于肝炎病毒科正戊肝病毒属B种，是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，主要流行4个基因型：澳大利亚和韩国的基因1型，美国的基因2型，中国和欧洲的基因3型，匈牙利和中国台湾的基因4型。

该病原引起的疾病最早可追溯到20世纪80年代澳大利亚、美国、加拿大等陆续报道的鸡大肝大脾病（bigliverandspleendisease，BLS）或肝炎脾大综合征（hepatitis-splenomegaly，HS），年确定病原并命名为禽戊型肝炎。

年我国就有BLS抗体阳性的报告，年和年分别从肉种鸡和蛋鸡群中分离到aHEV。aHEV多感染产蛋期鸡群，病程为1~2个月甚至更长，临床主要表现为死淘率升高（5%~15%）。

剖检可见，肝脾肿大、出血，卵泡萎缩变形等，后期易继发细菌感染。为分析我国aHEV基因变异情况，对年从山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地疑似感染aHEV鸡群中采集的肝脏、脾脏病料样品进行aHEVRT-PCR检测，并对aHEV阳性产物进行ORF1基因序列测定与遗传进化分析。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　病料　

年采集山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏9个省份疑似aHEV感染的鸡肝脏、脾脏样品共计份，无菌处理后，置于-20℃保存备用。

1.1.2　试剂

RNAout提取试剂盒，购自天恩泽生物公司；HiScript?IIOneStepRT-PCRKit，购自诺唯赞生物公司；DLDNAMarker，购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2　方法

1.2.1　引物设计　参照GenBank已公布的aHEV-ORF1基因核苷酸序列，利用Oligo6.0软件设计扩增aHEV-ORF1基因的特异性引物（aHEV-ORF1-F：5-FCGTCTCGCAGATAGCAGAGTCC-3；aHEV-

ORF1-R：5-TATAGCCCATTCCCGCTCAATC-3）。

引物由北京华大基因科技有限公司合成，预期扩增目的片段为bp。

1.2.2　病毒核酸提取　组织RNA和DNA提取，按核酸提取试剂盒和核酸提取仪说明书进行操作。

1.2.3　核酸扩增　用RT-PCR一步法试剂盒扩增cDNA：45℃反转录30min；94℃预变性3min，94℃变性40s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保存10min。

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，置于凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4　ORF1基因序列分析　挑取阳性样品产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用MegAlign和Mega6.0软件，对测定的aHEV-ORF1基因序列与GenBank中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。

2　结果

2.1　RT-PCR检测

对送检的份样品处理后进行RT-PCR检测，其中37份样品扩增出bp左右的目的片段（图1），为aHEV阳性。将测序结果与GenBank比对，结果均为aHEV。

2.2　ORF1基因同源性分析从不同地区RT-PCR阳性样品中，随机选取15个试验毒株ORF1核苷酸序列，利用MegAlign进行同源性比较。结果（图2）显示：试验株之间ORF1基因同源性为90.1%~%，而与基因1型的澳大利亚株和韩国株同源性为85.5%~89.0%，与基因2型的美国原型株和美国无毒株同源性为85.5%~88.2%，与基因3型的欧洲株和中国株同源性为86.3%~89.7%，与基因4型的匈牙利株和中国台湾株同源性为86.4%~88.5%。

2.3　ORF1基因遗传进化分析

利用Mega6.0对15株试验株的ORF1基因进行序列比较，绘制遗传进化树。结果（图3）显示：15株aHEV均属于戊型肝炎B种，形成独立的基因分支，但不属于已报道的4个基因型（基因1~4型）。

3　讨论

目前国内外都对aHEV进行了血清学和分子流行病学调查研究。我国南方鸡群aHEV血清阳性率约为33%，广东、山东、黑龙江3个省份的鸡群血清阳性率约为28.3%。这些血清学调查结果均显示，aHEV已在我国鸡群中广泛流行。但血清学调查只能反映鸡群的抗体水平，无法检测鸡群的病原感染情况，且病毒分离难度较大；而分子生物学方法操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好，已被广泛应用于临床检测。

ORF1基因编码aHEV的多聚蛋白，包含甲基转移化酶、解螺旋酶以及RNA依赖的RNA聚合酶。它们是目前国内外aHEV的主要分型依据。

本研究通过RT-PCR方法，对年山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地区疑似aHEV感染鸡群的份肝脏和脾脏病料样品进行aHEV检测，结果检出37份阳性样品，阳性检出率为5.45%，说明我国鸡群存在不同程度的aHEV感染，这应引起养鸡企业的高度重视。

通过对15株aHEV野毒株的ORF1基因进行测序分析，发现所检出毒株均属于B种，但不属于现已报道的4个基因型，为新亚型。通过核苷M.DLDNAMarker；酸同源性比对分析发现，15株aHEV野毒株与基因1~4型的代表株同源性均低于90%，而15株分离株之间的差异不大，同源性为90.1~%。目前关于aHEV新亚型的相关报道较少，本研究为我国aHEV的分子流行病学分析提供了补充和参考。

免责申明：本文所发资料信息来自鸡保姆整理。作者：张　翔，林婷婷，刘丰波，宋姗姗，李　彬，栾栋祖，王群，刘　平，刘红祥，马　冬，任衍倍，刘　东。

1

欢迎您